乳酸菌發(fā)酵果汁，又稱水果酵素，是一種利用乳酸菌發(fā)酵鮮果而成的飲品。乳酸菌發(fā)酵果汁過程中產生的有機酸、醛類、醇類和羧酸類等芳香成分，可改善其口感風味[1]，且有文獻表明：乳酸菌發(fā)酵可促進植物細胞壁降解[2-4]，有利于細胞中有效成分如抗氧化物質的釋放，增強果汁益生功能。

雪梨含有豐富的酚類物質[5]，表現出良好的抗炎及抗氧化活性[6-7]。雪梨制品，如雪梨膏、雪梨漿等，具有清咽潤喉的功能[8]。貝母含有多酚[9]、黃酮等多種抗氧化成分[10]，具有清熱潤肺，化痰止咳等功效[11]。人們常將貝母與雪梨組合食用，強化其益生功能，如：“貝母燉梨”、“貝母蒸梨”、“鮮梨貝母湯”等。

本研究將貝母、雪梨汁二者組合，并添加植物乳桿菌對其進行發(fā)酵，研究了發(fā)酵過程中影響抗氧化物質多酚、黃酮釋放的主要因素，并基于正交試驗對其工藝進行優(yōu)化，開發(fā)出一種具有優(yōu)良抗氧化性能[12-14]的新型功能性飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌Zw-1：河北省發(fā)酵工程技術研究中心保藏菌株；雪花梨：河北省趙縣；貝母：市售。

1.2 主要試劑

蛋白胨（BR）、牛肉膏（BR）、酵母浸粉（BR）、檸檬酸三銨（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、氫氧化鈉（AR）：北京奧博星生物技術公司；葡萄糖（AR）、乙酸鈉（AR）、磷酸氫二鉀（AR）、碳酸鈉（AR）、鐵氰化鉀（AR）、三氯乙酸（AR）：天津市永大化學試劑有限公司；吐溫80（AR）：上海源葉生物科技有限公司；硫酸鎂（AR）、硫酸錳（AR）、無水乙醇（AR）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；蔗糖：市售。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基

蛋白胨1.0 g，牛肉膏1.0 g，酵母浸粉0.5 g，葡萄糖2.0 g，檸檬酸三銨 0.2 g，吐溫 80 0.1 mL，乙酸鈉 0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，硫酸鎂0.042 g，硫酸錳0.025 g，調pH值為6.8～7.0，蒸餾水定容至100 mL。121℃滅菌20 min。

1.3.2 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基

優(yōu)良雪花梨梨汁100 mL，貝母粉（過40目篩）3 g，蔗糖15g。于85℃水浴滅菌30min，迅速冷卻至40℃。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

取斜面保藏的植物乳桿菌Zw-1一環(huán)，接種于100 mL種子培養(yǎng)基，36℃恒溫培養(yǎng)12 h至對數生長期。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

取5mL種子培養(yǎng)液，接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，36℃恒溫培養(yǎng)51 h。

1.4.3 樣品制備

發(fā)酵貝母-雪梨汁與對比樣品（貝母-雪梨汁和梨汁）的制備。

發(fā)酵貝母-雪梨汁：取100 mL雪梨汁，加貝母3 g，蔗糖15 g，于85℃水浴滅菌30 min，迅速冷卻至40℃，接入3%種子培養(yǎng)液，于36℃恒溫培養(yǎng)51 h；貝母-雪梨汁制備：取100 mL雪梨汁，加貝母3 g，蔗糖15 g，于85℃水浴滅菌30 min，迅速冷卻至40℃，于36℃恒溫培養(yǎng)51 h；梨汁制備：取100 mL雪梨汁，加蔗糖15 g，于85℃水浴滅菌30 min，迅速冷卻至40℃。于36℃恒溫培養(yǎng)51 h。

1.4.4 發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

1.4.4.1 植物乳桿菌接種量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

取基礎發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，以種子培養(yǎng)液接種量為變量，設置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，于36℃發(fā)酵培養(yǎng)51h。取上層清液，測定其多酚、黃酮含量。

1.4.4.2 貝母添加量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

取基礎發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，以貝母粉添加量為變量，設置梯度為 1、2、3、4、5 g，于 36 ℃發(fā)酵培養(yǎng) 51 h。取上層清液，測定其多酚、黃酮含量。

1.4.4.3 蔗糖添加量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

取基礎發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，以蔗糖添加量為變量，設置梯度為 5、10、15、20、25 g，于 36 ℃發(fā)酵培養(yǎng)51 h。取上層清液，測定其多酚、黃酮含量。

1.4.4.4 發(fā)酵時間對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

取基礎發(fā)酵培養(yǎng)基100mL，于36℃進行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵時間為變量，設置梯度為 31、36、41、46、51 h 。取上層清液，測定其多酚、黃酮含量。

1.4.5 貝母-雪梨汁正交優(yōu)化試驗

以多酚、黃酮釋放量為指標，選擇貝母添加量、發(fā)酵時間、植物乳桿菌接種量、蔗糖添加量為單因素，進行四因素三水平L9（34）正交試驗，見表1。

1.5 多酚、黃酮含量測定及抗氧化性能檢測方法

1.5.1 多酚濃度的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法。取1mL樣品于25mL比色管中，加入5 mL蒸餾水，1 mL顯色劑和3 mL 75%碳酸鈉溶液，搖勻，顯色2 h。以蒸餾水代替樣品作為空白對照。在765 nm波長下測定吸光度值，計算多酚濃度。

表1 因素水平表
Table 1 Factor level table

1.5.2 黃酮濃度的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法。取1 mL樣品于10 mL容量瓶，依次加入4 mL 70%乙醇和0.3 mL 5%NaNO2溶液，靜置6min。加入0.3mL10%Al（NO3）3靜置6 min。再加入4 mL 4%NaOH溶液，靜置10 min，用70%乙醇定容。以70%乙醇代替樣品作為空白對照。在510 nm波長下測定吸光度值，計算黃酮濃度。

1.5.3 還原力的測定-普魯士藍法

取樣品1 mL于試管中，加入2.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴反應20 min后迅速冷卻至25℃，立即加入2.0 mL 10%三氯乙酸終止反應。5 000 r/min離心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，暗室靜置反應30 min，于700 nm波長處測定吸光度值[15]。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁促進多酚、黃酮的釋放

植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁，有利于促進多酚、黃酮的釋放，如圖1所示。

由圖1可知，與貝母-雪梨汁相比，植物乳桿菌發(fā)酵后的貝母-雪梨汁中多酚、黃酮含量分別增加了25.71%和16.62%，與雪梨汁相比，貝母-雪梨汁復合物中多酚、黃酮含量也分別提高了17.37%和9.89%。且發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁與雪梨汁中多酚、黃酮含量對比差異顯著（P<0.05）。分析其原因可能為：在長時間的浸泡過程中，貝母細胞中的多酚、黃酮等有效成分借助于滲透和擴散作用，逐漸釋放到梨汁中，使得梨汁中多酚、黃酮含量升高。當利用植物乳桿菌對貝母-雪梨汁進行發(fā)酵時，植物乳桿菌可能分泌一些有利于貝母細胞壁降解的酶系，提高貝母胞內物質的釋放效率，從而進一步提高貝母-雪梨汁中多酚、黃酮的含量。

圖1 不同雪梨汁樣品多酚、黃酮含量比較
Fig.1 Comparison of polyphenols and flavonoids in different pear juice samples

2.2 發(fā)酵貝母-雪梨汁與貝母-雪梨汁、梨汁的抗氧化性能比較

將發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁和梨汁進行梯度稀釋，稀釋后濃度分別為樣品的 1/2、1/4、1/5、1/8和1/10，原樣品濃度設為1，稀釋濃度以0.1、0.125、0.2、0.25、0.5表示，縱坐標為吸光度值。各樣品Fe3+還原力測定結果見圖2。

圖2 不同雪梨汁樣品Fe3+還原力測定結果比較
Fig.2 Comparison of Fe3+reducing power determination results of different pear juice samples

研究證實，活性成分的抗氧化性能與還原力密切相關，即還原力越強，抗氧化活性越強。由圖2可知，發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁與雪梨汁3種樣品的還原活性，均隨樣品濃度的增大而增大。更重要的是，與浸泡相比，貝母-雪梨汁經植物乳桿菌發(fā)酵后，可顯著提高其還原活性，且濃度越高差異越明顯。

李偉偉等[16]研究發(fā)現益生菌發(fā)酵可降低膳食纖維粒徑，使其內部結構由原來致密的網狀結構變得蓬松易碎；發(fā)酵亦能顯著降低不溶性膳食纖維含量，增加可溶性膳食纖維含量。本試驗乳酸菌在以植物類中藥為基質進行發(fā)酵培養(yǎng)時，可能產生相應的物質定向作用于中藥細胞壁，促進胞內有效成分的釋放。由此可知，當將植物乳桿菌用于貝母-雪梨汁發(fā)酵培養(yǎng)時，該菌極有可能基于貝母細胞壁成分產生相應的復合降解酶系，加速貝母細胞壁破損過程，促進貝母胞內多酚、黃酮等有效成分的釋放，從而表現出更強的抗氧化活性。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁單因素及正交試驗優(yōu)化

為進一步提高植物乳桿菌發(fā)酵對貝母-雪梨汁抗氧化性能的強化作用，本文分別考察了植物乳桿菌接種量、貝母添加量、蔗糖添加量和發(fā)酵時間等因素對貝母-雪梨汁多酚和黃酮釋放量的影響。在此基礎上，以貝母-雪梨汁多酚和黃酮釋放量為指標，基于四因素三水平的正交優(yōu)化試驗結果，獲得植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁的最佳工藝條件。

2.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁單因素試驗

2.3.1.1 植物乳桿菌接種量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

植物乳桿菌接種量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖3。

圖3 植物乳桿菌接種量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum inoculum on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice

如圖3所示，在初始接種量較低時，隨乳桿菌接種量的增加，貝母-梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮含量隨之增加；當接種量為5%左右時，多酚、黃酮的含量均達到最大值；當接種量超過5%時，多酚、黃酮含量明顯下降，其中黃酮含量下降尤為明顯。由此可知，乳桿菌接種量將直接影響貝母-梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮的含量。當乳桿菌接種量過低時，發(fā)酵過程中植物乳桿菌活菌數過少，分泌到發(fā)酵體系中的破壁酶系較少，貝母細胞壁降解不徹底，導致細胞內多酚、黃酮等有效成分不能充分釋放。當乳桿菌接種量過高時，發(fā)酵體系中含有較多的植物乳桿菌活菌，一方面發(fā)酵體系中的營養(yǎng)物質用于滿足菌種自生生長所需，導致相關酶系合成不足，從而影響貝母細胞中多酚、黃酮等有效成分的釋放；另一方面，發(fā)酵體系中的多酚、黃酮類物質可能被植物乳桿菌作為營養(yǎng)物質消耗掉，導致體系中多酚、黃酮類物質含量降低。因此，植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁時，以5%接種量為最佳。

2.3.1.2 貝母添加量對發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

貝母和雪梨汁作為主要發(fā)酵基質，其配比對發(fā)酵過程中多酚、黃酮釋放量也有重要影響。本試驗以貝母添加量為變量，研究貝母與雪梨汁不同配比對發(fā)酵過程中多酚、黃酮釋放量的影響結果見圖4。

圖4 貝母添加量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.4 Effect of fritillaria addition on the release of polyphenol and flavonoids from fritillaria-pear juice

如圖4所示，當貝母添加量小于0.3 g/L時，多酚、黃酮的含量隨貝母添加量的增加而顯著增加；當貝母添加量超過0.3 g/L時，多酚、黃酮的含量則不再上升，整體趨于平衡。這一現象可能是由于在固定的發(fā)酵時間內，植物乳桿菌的濃度和分泌產生胞外酶量逐漸趨于飽和，因而多酚、黃酮釋放量不會隨發(fā)酵基質含量的增加而持續(xù)增加。因此，當貝母添加量為0.3 g/L時，發(fā)酵體系中多酚、黃酮的含量達到最優(yōu)值。

2.3.1.3 蔗糖添加量對發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

蔗糖既可作為植物乳桿菌發(fā)酵的碳源，也可改善發(fā)酵貝母-雪梨汁的口感，因此，在貝母-雪梨汁發(fā)酵體系中以蔗糖作為添加物。蔗糖添加量對發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖5。

圖5 蔗糖添加量對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.5 Effect of sucrose addition on polyphenol and flavonoids release in fritillaria-pear juice

如圖5所示，發(fā)酵液中多酚、黃酮含量隨蔗糖添加量的增加，呈現先增加后減小的變化，當蔗糖添加量為15%時，發(fā)酵液中多酚、黃酮含量達到最大值。分析其原因可能為：當蔗糖含量過低時，發(fā)酵體系中乳桿菌數量較少，分泌產生的降解酶系亦較少。當蔗糖濃度過高時，抑制了植物乳桿菌的正常生長和胞外蛋白酶的分泌，導致貝母細胞破壁效果差，限制了多酚、黃酮等有效成分的釋放。

2.3.1.4 發(fā)酵時間對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響

植物乳桿菌的生長發(fā)酵受時間以及發(fā)酵周期的影響。發(fā)酵時間對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.6 Effect of fermentation time on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice

如圖6所示，與上述3種單因素影響不同，植物乳桿菌發(fā)酵時間對貝母-雪梨汁中多酚和黃酮釋放量影響并不完全一致。盡管多酚和黃酮釋放量隨發(fā)酵時間呈現先增加后減少的變化曲線，但發(fā)酵體系中黃酮含量在41 h時達到最大值，隨后急劇下降，而多酚含量在46 h時達到最大值，滯后于黃酮含量峰值的出現時間。這一現象可能受多酚、黃酮分子量大小的影響，不同分子量的物質從胞內釋放速率略有差異。整體而言，發(fā)酵初期隨著發(fā)酵體系中乳桿菌數量的增加，貝母和雪梨細胞壁破碎程度增加，大量的多酚、黃酮被釋放到發(fā)酵液中；但隨著發(fā)酵時間的延長，底物不斷消耗，部分多酚、黃酮可能被乳桿菌消耗以滿足自身生長需要，導致發(fā)酵貝母-雪梨汁中多酚、黃酮的含量產生下降趨勢。

2.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁最佳工藝研究

對影響貝母-雪梨汁乳桿菌復合發(fā)酵的貝母添加量（A）、發(fā)酵時間（B）、乳桿菌接種量（C）和蔗糖添加量（D）4個因素進行三水平正交試驗優(yōu)化，以貝母-雪梨汁發(fā)酵體系中的多酚和黃酮含量為評價指標進行加權綜合評定，試驗結果如表2、表3所示。

表2 正交試驗表
Table 2 Orthogonal test table

續(xù)表2 正交試驗表
Continue table 2 Orthogonal test table

由表2的結果可知：以多酚含量為評價指標時，4個因素對發(fā)酵貝母-雪梨汁的影響依次為：發(fā)酵時間（B）>貝母添加量（A）>乳桿菌接種量（C）>蔗糖添加量（D），多酚含量最高的工藝參數組合為：A2B2C1D3，即貝母添加量為0.3 g/L，發(fā)酵時間為41 h，乳桿菌接種量為3%，蔗糖添加量為1.5 g/L。以黃酮含量為評價指標時，各因素對發(fā)酵貝母-雪梨汁的影響依次為：蔗糖添加量（D）>發(fā)酵時間（B）>乳桿菌接種量（C）>貝母添加量（A），黃酮含量最高的工藝參數組合為：A2B2C2D3，即貝母添加量為0.3 g/L，發(fā)酵時間為41 h，乳桿菌接種量為5%，蔗糖添加量為1.5 g/L。多酚和黃酮含量最高值對應的最優(yōu)工藝參數組合分別為：A2B2C1D3和A2B2C2D3，二者差異在于C工藝參數的不同。由表3正交試驗方差分析可知，因素C對發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮含量的影響為不顯著因素。以C為變量，進行驗證試驗，結果發(fā)現多酚、黃酮含量最高的工藝組合為A2B2C2D3，即貝母添加量為0.3 g/L，發(fā)酵時間為41 h，乳桿菌接種量為5%，蔗糖添加量為1.5 g/L，測得多酚含量為298.75 mg/L，黃酮含量為961.27 mg/L。

由表3正交試驗方差分析可知：貝母添加量（A）對于貝母-雪梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮的含量均有顯著影響；發(fā)酵時間（B）對貝母-雪梨汁發(fā)酵液中多酚含量影響顯著；蔗糖添加量（D）對發(fā)酵液中黃酮含量影響顯著。乳桿菌接種量（C）對多酚、黃酮含量的影響不顯著。

表3 正交試驗方差分析表
Table 3 Orthogonal test analysis of variance

注：*p<0.05差異顯著。

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁工藝優(yōu)化前后抗氧化能力測定

比較不同稀釋濃度（0.1、0.125、0.2、0.5、1）下發(fā)酵貝母-雪梨汁優(yōu)化前后抗氧化能力的變化見圖7。

圖7 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁工藝優(yōu)化前后抗氧化能力測定
Fig.7 Determination of antioxidant capacity of Lactobacillus plantarum fermented fritillaria-pear juice before and after optimization

由圖7可知，優(yōu)化后的植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁抗氧化能力較優(yōu)化前有明顯提高，樣品濃度越高時，抗氧化效果差距越明顯（p<0.05），與之前測定的發(fā)酵液中多酚和黃酮類物質含量結果一致。結果表明，發(fā)酵貝母-雪梨汁新型功能性飲料的抗氧化性能與多酚、黃酮的含量呈正相關，即多酚、黃酮含量越高，抗氧化效果越明顯。

3 結論

該研究通過植物乳桿菌發(fā)酵的方式，對貝母-雪梨汁的抗氧化功能進行強化，以生產出具有保健功能的貝母-雪梨汁飲品。結果發(fā)現，乳桿菌發(fā)酵可顯著增加貝母-雪梨汁中多酚和黃酮的含量，與未發(fā)酵組相比二者含量分別提高了33.03%和27.60%，且表現出更好的抗氧化效果。

以多酚和黃酮含量為指標，通過正交試驗優(yōu)化獲得植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁的最佳工藝條件：植物乳桿菌接種量5%，蔗糖添加量1.5 g/L，發(fā)酵時間41 h，貝母添加量0.3 g/L，最終發(fā)酵貝母-雪梨汁中多酚含量為298.75 mg/L，黃酮含量為961.27 mg/L。發(fā)酵貝母-雪梨汁口感良好，具有良好的抗氧化功能，是理想的新型保健飲品，具有一定的發(fā)展前景。