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在“硒”望田野上、發(fā)展功能農(nóng)業(yè)健康產(chǎn)業(yè)夢

   高產(chǎn)農(nóng)業(yè)是為了“吃飽肚子”，是讓每個人不挨餓，是很長時間以來農(nóng)業(yè)的重要任務(wù)，甚至在未來仍是中國農(nóng)業(yè)人的重要工作之一；

綠色農(nóng)業(yè)是“吃得安全”，屬于第二個階段，這個階段的重心是保持良好生態(tài)基礎(chǔ)，盡量減少農(nóng)產(chǎn)品中有害的東西，有機農(nóng)業(yè)是這一階段的最高級；

功能農(nóng)業(yè)則是為了“吃得健康”，屬于第三個階段。通過農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)化、功能化，讓它成為維護、提升人體健康的重要載體。

   在外源DNA導入植物技術(shù)，是將帶有目的性狀基因的供體總DNA片段導入目的植物，篩選獲得目的性狀的后代，培育新品種，屬遠緣雜交。應用該技術(shù)，不需要原生殖體或細胞等離體組織培養(yǎng)和誘導再生植株，易于育種工作者掌握和實踐，可以在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上發(fā)展分子育種。技術(shù)食品經(jīng)檢測系非轉(zhuǎn)基因食品，安全可靠，能夠大大降低勞動力成本。可使目的植物達到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多功能性等特征！

外源DNA直接導入植物技術(shù)的設(shè)想，是中國科學院上海生物化學研究所周光宇教授1974年在我國率先提出來的，何登驥被這個全新的技術(shù)科學原理和科學概念所吸引，與周光宇合作。

1996年省科委將水稻研究所主持的，外源DNA導入技術(shù)培育水稻新品種列入“九五”攻關(guān)課題。何登驥老師參與了水稻花粉管通道育種技術(shù)研究。在實際操作中，他發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在低世代，優(yōu)勢特征不明顯，可控性差等問題。為找出一套行之有效的解決方法，一是查閱資料作讀書筆記，二是積極探索增加動手能力。

這種技術(shù)不僅具有不改變傳統(tǒng)水稻固有的遺傳性狀，同時把水稻品種有益的隱形性狀轉(zhuǎn)為顯性。經(jīng)過20余年的進一步探索，準確掌握了一套新型花粉管通道分子育種技術(shù)。這套生物育種技術(shù)，在他的研究所使水稻育種變得更快捷、穩(wěn)定，可控性強，安全、實用性更廣泛。

目前已經(jīng)育成一批帶有目的性狀的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻、耐鹽水稻、含低隔水稻新品系、香型水稻品系、富硒水稻品系、旱稻品系等水稻品種和稻種資源。選育出的水稻新品種（系）在長相、產(chǎn)量、品質(zhì)、功能、抗性、適應性等方面比原來傳統(tǒng)水稻有很大程度的提高和發(fā)展。 

如我們看到的大穗苦瓜早稻517（功能性1號）:于2008年6月提取食用苦瓜外源總體DNA導入受體水稻新品系8早8112【P47（早稻85-183+玉米）+湘早秈27號】，經(jīng)2009年至2013年每年在湖南長沙東郊和海南三亞種植選育，于2014年穩(wěn)定，2015年作早稻新品系觀察，2016年進入早稻品比試驗，兩次重復，全生育期118天。平均畝產(chǎn)1362.5斤。比對照早優(yōu)604（畝產(chǎn)875.4斤），增產(chǎn)35.8%。

經(jīng)湖南省農(nóng)科院稻米及制品檢測中心化驗分析結(jié)果：糙米率79.72%，精米率75.36%,整精米率61.07%，里白度乳白米長6.45毫米，長寬比3，直鏈淀粉0.91%，膠稠度105米，糊化濃度2級，蛋白質(zhì)含量9.68%。隔含量為0.12mg/kg，屬低隔水稻品種！該品系莖桿粗壯，葉片挺直，耐肥抗倒，特大穗，高結(jié)實，每畝有效穗15.2萬，每穗總粒數(shù)350—650粒，結(jié)實率95%。表現(xiàn)突出，2017年已獲農(nóng)業(yè)部保護。 

     無極道控股集團趙紅梅由韶關(guān)市發(fā)展研究中心，仁化縣政府辦、農(nóng)機局領(lǐng)導陪同考察！

   我們陪何登驥老師前幾年與無極道集團合作在仁化縣的種植中感悟，一切新品種和新農(nóng)藝都不是突如其來，自我發(fā)育和自我生長起來的，而是來自最純粹的科學領(lǐng)域持續(xù)不懈的艱難探索得來的?？上驳氖牵诤蔚求K老師的不懈努力指導下，種植的優(yōu)質(zhì)稻種，即將為健康產(chǎn)業(yè)形成訂單農(nóng)業(yè)，對社會的貢獻也在產(chǎn)生積極影響。 

據(jù)悉，從2020年春與廣東省樂昌市泗洲農(nóng)林畜牧專業(yè)合作社簽訂了合作開發(fā)雙季種植試驗協(xié)議。在今年規(guī)模種植的“功能早生1”水稻據(jù)湖南省農(nóng)業(yè)科學院稻米及制品檢測分析室分析結(jié)果為:（1）出糙率為81.5%，（2）整糙米率61.6%、（3）晉白粒率4.5%、（4）晉白率0.3%、（5）長寬比3.6，五項指標全部符合“優(yōu)質(zhì)稻谷”一等標準。

現(xiàn)已83歲高齡的何登驥老師成功地把其他農(nóng)作物、植物DNA導入水稻，培育出一個個新型品種（系）。培養(yǎng)出來的新品種不僅在提高米質(zhì)上取得驕人成績，而且在人們食用后發(fā)揮出保健作用。這些稻米，有的可以增鈣，有的可以補硒，有的可以降糖，有的可以養(yǎng)顏，有的可抗癌，增強免疫力；還有一種特殊成份叫“生物警察”，專抓體內(nèi)致癌基因—自由基。人們食用了這些稻米，就象給自己身體注入了“長壽基因”、 “健康基因”、“美麗基因”。任何收獲不是巧合，這些優(yōu)質(zhì)大米即將走進平常百姓家；而是每天的努力與堅持得來的。

為實現(xiàn)花粉管道法將外源DNA導入水稻的育種目標，在逐夢的實踐路上，一步一個腳印，持續(xù)不懈的艱苦探索，熟練掌握了一系列花粉管通道法的育種技術(shù)為實現(xiàn)花粉管通道法水稻育種技術(shù)產(chǎn)業(yè)的成果付出的堅辛勞動，就像一個大國工匠，逐圓農(nóng)科夢！

        “中國最美縣域——樂昌”直播團隊助力“2017中國最美古村落”農(nóng)特產(chǎn)品的銷售。圖為直播團隊調(diào)研樂昌時到廊田鎮(zhèn)樓下古村考察，該村黨總支部書記鄧泗洲（中）與CCTV17“最美縣域”展播團隊成員合影。

樂昌市廊田鎮(zhèn)樓下村位于樂昌市東部，廊田鎮(zhèn)最南部，總面積約20平方公里，有“粵北糧倉”之稱、距離樂昌市政府11公里，距離廊田鎮(zhèn)政府4公里。樓下村下轄樓下、圩坪、鹿江等3個自然村, 村居民人口 4276人、總戶數(shù)1016戶，樓下村是一個近1500年歷史的古村落，歷史上曾經(jīng)出過多名進士縣令以上官員，歷史文化底蘊深厚，2017年曾被文博會評為“中國最美古村落”！主要種植水稻、蔬菜、馬蹄、香芋等農(nóng)作物，共有耕地面積4426畝。 

  附件:論文被湖南農(nóng)業(yè)大學學報錄用，2021.1見刊。 

還花粉管導入苦瓜DNA秈稻的全基因組重測序及精米營養(yǎng)品質(zhì)分析 

袁潔¹ 何登驥² 何加太² 詹慶才³ 周昆² 何艷¹ 陽永建¹ 魏穎娟⁴ 陶湘林⁴ 唐漢軍^1，4*

（湖南大學研究生院隆平分院¹，長沙 410125）

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所²， 長沙 410125）

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所³， 長沙 410125）

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所⁴，長沙 410125） 

摘 要 本研究針對花粉管通道法導入苦瓜DNA的秈稻子代D9和受體RT，采用Illumina HiSeq^TM平臺進行了全基因組重測序，并分析了精米的基本營養(yǎng)成分、總皂苷成分以及膨脹勢和米飯的食味品質(zhì)。結(jié)果表明，苦瓜的部分DNA片斷被整合進了受體水稻的DNA中，并在預期的皂苷成分含量上陽性表達，苦瓜基因?qū)λ镜臓I養(yǎng)成分生成有改善作用，對食味口感有負面作用。

關(guān)鍵詞  苦瓜DNA  花粉管通道法  秈稻  堿基序列  營養(yǎng)品質(zhì) 

WGS and white rice nutrition quality analysis of the bitter melon DNA of

the pollen tube imported indica rice

Yuan Jie¹ He Dengji² He Jiatai² Zhan Qingcai³ Zhou Kun² He Yan¹ Yang Yongjian¹

Wei Yingjuan⁴ Tao Xianglin⁴  Tang Hanjun^1,4＊

（Longping Branch, Graduate School of Hunan University¹, Changsha 410125）

（Rice Research Institute of Hunan Agricultural Sciences Academy², Changsha 410125）

（Biotechnology research institute of Hunan Agricultural Sciences Academy², Changsha 410125）

 （Agricultural Products Processing Institute of Hunan Agricultural Sciences Academy³,

Changsha 410125）

Abstract Offspring D9 from Indica rice imported bitter melon DNA by pollen tube channel method and the receptor (RT), and the whole genome was sequenced by Illumina HiSeq^TM in this research. At the same time, the nutritional composition contents and total saponin content in milled rice, and the swelling power and the edible quality of milled rice were analyzed. The results indicated that parts of the melon's DNA fragment were integrated into the rice's DNA and the positive expression on expected saponin content. The bitter melon gene have improvement on the nutrients and a negative effect on taste in rice.

Key words Bitter melon DNA, Pollen tube channel method, Indica rice, Base sequence, Nutritional quality

1、前言:

花粉管通道法是周光宇等^［1］于上世紀80年代創(chuàng)立的一種遠緣DNA片段雜交的分子育種技術(shù)。數(shù)十年來，基于該技術(shù)我國科學家相繼在玉米^［2-6］、小麥^［7-11］、水稻^［12-13］、棉

花^［14］、芝麻^［15］、胡麻^［16］、楊樹^［17］等糧食、經(jīng)濟作物和林業(yè)領(lǐng)域創(chuàng)制出大量的新品種、新品系和育種資源，為我國農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟發(fā)展作出了巨大的貢獻。這些研究成果主要以改進作物農(nóng)藝性狀和提高產(chǎn)量為目的。但隋著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生活節(jié)奏加快、工作壓力加大，亞健康人群激增，人們的健康意識普遍增強。在此大背景下，普通食品功能化和功能食品主食化成為大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要趨勢^［18］。近年高蛋白質(zhì)、高賴氨酸、低谷蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)高血壓、富鐵、富硒、富鋅 抗過敏、高半胱氨酸、功能肽、花青素、巨胚等，以強化或降低稻米原有的某個成分的功能稻新品種相繼問世^［19-20］，但以導入遠緣物種活性物質(zhì)為目的的水稻品種還少見。

    苦瓜是一種富含多糖、生物堿和苷類等活性化合物的常見蔬菜，具有降血糖^［21-27］、防止骨質(zhì)疏松^［28］、抗氧化防衰老^［29-30］、預防脂肪肝^［31］和抗癌^［32］等作用。本團隊應用花粉管通道法將苦瓜DNA導入秈稻，經(jīng)過多年的篩選，獲得了農(nóng)藝性狀較好、遺傳穩(wěn)定的子代。本研究主要目的是驗證農(nóng)藝性狀優(yōu)良的子代DNA中是否融合進了預期的苦瓜活性成分相關(guān)的基因片段，并在營養(yǎng)品質(zhì)上能夠陽性表達。 

2、試驗材料與方法

2.1材料

   試驗材料：苦瓜DNA導入水稻子代第9代稻谷（試驗編號D9、2018年、湖南）和受體秈稻稻谷（試驗編號RT、2018年、湖南）為湖南省水稻研究所何登驥研究員提供。

   主要試劑：Tris、HC1、蔗糖、瓊脂糖、人參皂苷標準物質(zhì)、香草醛、醋酸酐、乙醇、硫酸等及其它試劑均采用優(yōu)級純或分析純。

2.2主要儀器SCIENTZ-950E超聲波細胞破碎儀（寧波新芝）、Centrifuge 5418 R 冷凍離心機（德國）， PF-20R高速冷凍離心機（湖南平凡）、Sup-756紫外分光光度計（上海光譜）、Illumina HiSeq^TM測序儀（美國）、JB-10磁力攪拌器（常州澳華）、BF51894JC-1馬弗爐（美國）、GFL-70鼓風干燥箱（天津萊伯特）、XJS20石墨消解儀（天津萊伯特）、STA1B米飯食味儀（日本佐竹）。

2.3方法

2.3.1 總DNA提取與檢測

   稻谷通過實驗室盆栽育苗，大約生長到500px左右，取幼苗葉片組織適量，參照閆雙勇等的方法^［33］提取葉片全DNA。DNA純度采用NanoDrop2000 方法檢測，DNA濃度采用Picogreen方法檢測，DNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測。

2.3.2 DNA全基因測序

    測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司實施。樣品基因組DNA檢測合格后，利用超聲波將DNA序列片段化形成隨機片段，對片段化的DNA依次進行末端修復，3′端加A連接測序接頭后，再利用磁珠吸附富集基因組長度為400 bp左右的片段，經(jīng)過PCR擴增形成測序文庫。建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq^TM平臺進行測序，測序策略為Illumina PE150，總測序讀長為300 bp。Illumina測序錯誤率見表1.

在Illumina HiSeq^TM平臺測序的原始數(shù)據(jù)下機后，采用Fastp應用軟件（0.19.6版）對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，過濾其中低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，具體處理見表2。對獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，利用 BWA 應用軟件（0.7.17版）將高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對到參考基因組序列上，獲得序列的位置歸屬（即BAM 文件）。

表1 Illumina HiSeq^TM的測序錯誤率

表2 原始數(shù)據(jù)過濾處理

 2.3.3 苦瓜基因序列鑒定

將D9樣本的測序序列與苦瓜基因組比對，保留完全比對上的序列，再將保留的

序列與RT樣本序列比對，去除和RT對上的讀段，獲取苦瓜獨有的基因序列。比對用苦瓜基因組數(shù)據(jù)來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Momordica+charantia。

2.3.4 精米的基本營養(yǎng)成分含量分析

將精米粉碎成100目的粉體備用，采用AOAC法^［34］分析基本營養(yǎng)成分，糖分（%）=100-粗蛋白-粗脂肪-膳食纖維-灰分。

2.3.5 精米的總皂苷含量分析

    準確稱取精米粉5 g，加入80%乙醇溶液75 mL, 于90 ℃回流提取1 h, 重復2次, 合并提取液定容后作為分析樣品, 以人參皂苷為標準樣品，參照張中偉等的比色法測定含量^［35］。

2.3.6 膨脹勢的測量

   采用Tang等^［36］的方法，準確稱取精米粉1 g，加水20 mL，制取糊化膠體后，分析重量。膨脹勢（g/g）=糊化膠體重/精米粉重。

2.3.7 米飯質(zhì)構(gòu)和食味分析

   參照趙春芳等的方法^［37］采用日本佐竹食味儀分析。

2.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

   所有試驗數(shù)據(jù)均采用Excel2016和SPSS7.0軟件進行統(tǒng)計分析。 

結(jié)果與分析

3.1 谷粒和糙米形態(tài)

   苦瓜DNA導入水稻的子代（D9）和受體水稻（RT）的谷粒及糙米的形態(tài)、大小和顏色在目測下沒有明顯的差異（圖1）。

圖1 水稻籽粒的形態(tài)。上行為RT的谷粒和糙米；下行為D9的谷粒和糙米。 

 3.2 苦瓜基因序列鑒定

    以實驗室盆栽培育的幼苗葉片組織作為總DNA的提取材料，最終獲得了RT的總DNA4.0 μg，D9的DNA2.9 μg，經(jīng)過純度檢測OD值均大于1.8，總量滿足兩次標準建庫需求

（表3），并進一步通過凝膠電泳檢測，如圖2所示得到了單一條帶圖譜，說明DNA樣品完整，滿足測序要求。

表3 水稻幼葉總DNA的濃度和純度

 圖2 水稻葉片總DNA的凝膠電泳檢測。

上述樣品基因組DNA檢測合格后，采用超聲波將DNA序列片段化，對片段化的DNA依次進行末端修復，3′端連接測序接頭后，再利用磁珠吸附富集基因組長度為 400 bp 左右的片段，經(jīng)過PCR 擴增形成測序文庫。建好的文庫質(zhì)檢合格后，采用Illumina HiSeq^TM平臺進行測序，測序策略為Illumina PE150，總測序讀長為300 bp。通過對堿基含量分布和錯誤率分布統(tǒng)計分析合格后，進行測序數(shù)據(jù)過濾處理，獲得的高質(zhì)量讀段結(jié)果如表4所示。RT和D9的高質(zhì)量讀段數(shù)分別為57565143和54414968，總堿基數(shù)分別為17343050961和16394835413，GC含量分別為43.13%he 43.06%，修剪接頭后質(zhì)量值大于或等于30堿基片斷（Q30）占總讀段的比例分別達到93.19%和92.92%。 

表4 水稻幼葉DNA片段測序數(shù)據(jù)過濾結(jié)果

將D9樣本的高質(zhì)量讀段測序序列與苦瓜基因組比對，完全比對上的序列保留，再將保留序列與RT樣本序列進行比對，去除和RT對上的讀段，最終獲得了表5所示的11條苦瓜特有的基因序列。這些結(jié)果表明，通過花粉管導入法苦瓜的部分DNA片斷被整合進了水稻的DNA中，并能穩(wěn)定遺傳給子代，形成了新的水稻品種。  

表5 D9幼葉DNA中的苦瓜獨有堿基序列

 注：“>”開頭的是讀段的名稱（標識符）。 

3.3 精米的基本營養(yǎng)成分分析

   精米的基本營養(yǎng)成分如表6所示?？傮w上各成分含量與前報道的秈稻米數(shù)據(jù)類似^［38-39］。蛋白質(zhì)和糖分的含量D9和RT之間沒有變化，D9脂肪含量有意減少，膳食纖維和灰分含量有意增加。從現(xiàn)代大健康產(chǎn)業(yè)和消費者志向的角度考察，苦瓜基因的導入對精米的營養(yǎng)成分組成有改善作用。

表6 精米的基本營養(yǎng)成分（干基）

 注：同列不同英文字母表示顯著差異（p＜0.05），n=3。

 3.4 精米的總皂苷含量分析

    苦瓜的主要活性成分是皂苷類化合物^［21-32］，針對精米的乙醇提取物采用醋酸酐-硫酸法和香草醛-硫酸法進行了總皂苷顯色分析（圖3）。兩種方法D9均發(fā)生了與前報道^［35］相同的顯色反應，以人參皂苷為標準物質(zhì)定量分析的結(jié)果，RT為108.2 mg/100g，D9為605.1 mg/100g，D9顯著高與RT，達5倍以上。因分析樣品是粗提取物，蛋白質(zhì)、糖類、黃酮類、甾體類、其它生物堿等成分也可能有顯色，一般分析值偏高^［35］，RT的值也許是非皂苷類的貢獻^［39］。為獲得更準確的數(shù)據(jù)，有待進一步提高分析樣品純度進行分析，但基本上可以判斷苦瓜功能成分的相關(guān)基因在水稻籽粒中有陽性表達，達成了預期的育種目標，可以期待該品種在高血糖等亞健康人群的健康飲食上發(fā)揮積極作用。

圖3 總皂苷的比色分析。a和b為RT的乙醇提取物；c和d為D9的乙醇提取物。上圖為醋酸酐-硫酸法；下圖為香草醛-硫酸法。

3.5 精米及米飯的物理特性和食味分析

   表7表示精米及米飯的物理特性和食味分析結(jié)果。精米粉完全糊化后的膨脹勢，RT為15.5 g/g，D9為14.8 g/g，略低于RT，與前報道的秈稻米膨脹勢類似^［38］。米飯質(zhì)構(gòu)的3個指標，D9的硬度高于RT，黏度和彈性沒有差異。食味評價各指標值，D9均低于RT，但與前報道的“南粳5055”和“美東194”等粳稻食味評價值類似^［37］，說明D9在食味品質(zhì)上雖比RT有所降低，但依然達到了優(yōu)質(zhì)米的級別。這些結(jié)果表明苦瓜基因?qū)κ荏w的淀粉合成基因表達可能有不良干擾，其影響和機理有待今后進一步研究。

表7 精米及米飯的物理特性和食味評價

注：同行不同英文字母表示顯著差異（p＜0.05），n=6。

 結(jié)論

通過花粉管導入法苦瓜DNA的部分片段融合進了秈稻DNA中，并獲得了穩(wěn)定遺傳的子代；

融合進秈稻DNA中的苦瓜基因片段中包含有預期的苦瓜活性成分相關(guān)基因，并能夠陽性表達，達成預期的育種目標；

融入到秈稻DNA結(jié)構(gòu)的苦瓜基因?qū)λ镜臓I養(yǎng)成分生成有改善作用，但對食味口感有負面影響，其作用機理有待進一步研究。 

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